| 技术中心 |
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| 03/02/09 |
一 清洗与消毒
1.玻璃器皿的清洗
清水浸泡——洗衣粉刷洗——自来水冲洗——晾干，浸酸过夜——自来水冲洗10次以上——蒸馏水洗2-3次——烘干，包装——灭菌，贮存备用。
2.培养板的清洗
用后立即浸入水中——洗衣粉清洗——自来水冲洗——晾干，浸酸(强酸)过夜——自来水冲洗10次以上——蒸馏水洗2-3次——烘干，浸入 70%乙醇（盖盖以防乙醇挥发。临用前取出，在空气中干燥，置干净盒内备用。
*注意不宜用毛刷刷洗，如残留有附着物，可用脱脂棉蘸水拭掉，流水冲洗干净。
3.载玻片的洗涤
新玻片
自来水冲洗——晾干，洗液中浸泡数小时 ——流水冲洗数小时——蒸馏水冲洗数遍——浸入70%乙醇（盖盖以防乙醇挥发）。临用前取出，在空气中干燥，置盒内备用。
旧玻片
肥皂水煮沸——温肥皂水洗——流水冲洗——晾干，洗液中浸泡数小时——流水冲洗——蒸馏水冲洗数遍——浸入 70%乙醇（盖盖以防乙醇挥发）。临用前取出，在空气中干燥，置盒内备用。
* 注意不要彼此紧贴在一起
4.胶塞的清洗
自来水浸泡——2% NaOH煮沸10~20分钟——自来水冲洗——1%稀HCl浸泡30分钟——自来水冲洗——蒸馏水冲洗2~3次——晾干，备用。
灭 菌
[原理]
使用电热手提式压力蒸汽灭菌器，利用在密闭容器内加热，水就能生成压力蒸汽，蒸汽的温度随着压力的增高而上升，具有良好的穿透性，能使容器内的物品迅速潮润和加热的原理，使微生物迅速被杀灭，最终达到灭菌的效果。
[方法]
1. 使用前，先检查主体内水位是否超过电热管。
2. 在加热开始时，放气阀垂直，使空气随加热由桶内逸出。待有较急的蒸汽喷出时，即将放气阀拨回水平位置。
3. 瓶皿 121-126℃ 15min
器械 121-126℃ 10min
橡胶 121℃ 15min
溶液 121-126℃ 20-40min
4. 当压力到达所需的范围时，开始计算时间 。124-126℃ 灭菌时，安全阀能使之维持恒压；低于124℃时，则应在蒸汽压力到达所需范围时，适当调节开关使之维持恒压。
5. 灭菌完，要迅速使之干燥者，将灭菌器内的蒸汽通过放气阀迅速排出。等 压力为0时，再稍等1-2分钟，然后将盖打开，继续加热10-15分钟，使物品上残留的水蒸汽得到蒸发，随后关掉；灭菌液体时，应将液体灌装在 玻璃瓶中，以不超过3/4体积为好，瓶口用棉花纱布塞好，并用绳子扎在 瓶颈上，使瓶内的空气能自然泄出，而又不致使瓶塞落入瓶内。灭菌完， 先关电源，等压力为0时，再稍等几分钟，打开放气阀，排出余气后，才能将盖开启。
[注意]
1. 在加热液体时，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞。
2. 液体灭菌终了时，切勿立即释放蒸汽，否则，由于液体的温度未能迅速下降，而压力蒸汽突然释放，会使液体剧烈沸腾，造成溢出或容器爆裂等危险事故。
3. 经常清洗主体，以保证电热管的正常工作。
溶液配制
1. 洗液的配制
重铬酸钾先溶于水中，然后，将浓硫酸缓慢加入。
[强液] 重铬酸钾 63 g
浓硫酸 1000 ml
蒸馏水 200 ml
2.泡烧结玻璃滤器
NaNO3 10 g
水 470 ml
浓H2SO4 28.6 ml
3.培养液的配制
1. 把干粉加入15-30℃（室温）三蒸水中，缓慢搅拌令之溶解，并将袋中微量粉末冲下。
2. 加NaHCO3 2.0g / L 1640培养液 或3.7g / L DMEM培养液。稀释至1 L。
3. 用1N HCl或1N NaOH将pH调低于正常pH* 0.2-0.3。（在正常情况下，培养液pH介于7.2-7.4间，呈桃红色。）
4. 立即过滤消毒。
* 通常过滤后pH升高0.1-0.3
4.消化液的配制
0.25%胰蛋白酶
1. 将pH 7.2的PBS液高压消毒灭菌。
2. 称取胰蛋白酶粉末0.25g，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡。
3.过滤灭菌，分装入瓶，-20℃冰箱保存。
5. BSS的配制
PBS（克/升）
1. 准确称量试剂。(含有水份的水化物，与不含水份者的称量不同，应加以换算。)
KCl 0.2
KH2PO4 0.2
NaCl 8.0
Na2HPO4·7H2O 1.56
2. 依次溶解在750 ml水中，待前一种试剂完全溶解后，再溶解下一种成分。
3. 补足水分。
4. 分装瓶中，高压灭菌10 min，4℃冰箱保存。
6．Hank's液
KCl 0.4g
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.06g
MgCl2×6H2O 0.1g
MgSO4× 7 H2O 0.1 g
NaHCO3 0.35g
NaHPO4×7 H2O 0.06g
D-葡萄糖 1.0g
酚红 0.01g
CaCl2 0.14g
1. 以上成分依次溶解于三蒸水中，并不时搅动（注意应待前一种试剂完全溶解后再溶解下一种成分）。
2. 将配好的溶液移入容量瓶中，补足水至刻度，充分均匀。
3. 分装瓶中，高压蒸气灭菌，4℃保存。
7．D-Hank's液
KCl 0.4g
NaCl 8.0g
KH2PO4 0.06g
NaHCO3 0.35g
NaHPO4×7 H2O 0.06g
酚红 0.01g
1. 以上成分依次溶解于三蒸水中，并不时搅动（注意应待前一种试剂完全溶解后再溶解下一种成分）。
2. 将配好的溶液移入容量瓶中，补足水至刻度，充分均匀。
3. 分装瓶中，高压蒸气灭菌，4℃保存。
细胞培养技术
1. 细胞计数法
1．悬液制备：取待测细胞，向培养瓶内加1ml 0.25%胰蛋白酶液，37℃温箱中消化，至细胞接近脱离瓶壁前吸出消化液，加新的培养液5.0ml，轻轻吹打制备成细胞悬液。
2．染色：取吸管1支，伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向离心管中滴入9滴，再滴入0.4%的台盘蓝染料1滴，混匀，置2-3min。
3．镜检：把计数板平放在显微镜台上，从边缘滴1-2滴已染色的细胞悬液。镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康者。
4．计数：细胞数/ml悬液=（4大格细胞总数/4）*104 * 毫升数
5． 接种：一般接种量在105-106细胞/ml范围。00
2.细胞传代
a.将瓶中的培养液倒出，加入约2ml的消化液，平放3-5分钟，镜检，细胞变圆时将消化液倒去。加入一定量的培养液，用吸管将瓶壁上的细胞吹打下来，尽量吹散。
b.培养中的细胞分瓶，并加入培养液8-10ml，置培养箱中培养。
c.悬浮细胞传代时，只需吸出少量细胞转入新瓶，并补足营养液即可。
3.冻存
a.将瓶中的培养液倒出，加入约2ml的消化液，平放3-5分钟，镜检，细胞变圆时将消化液倒去.
b.加入一定量的冻存液（约为20万细胞/ml冻存液），用吸管将瓶壁上的细胞吹打下来，尽量吹散。
c.将