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     　　随着对疾病分子机制认识的加深及生物技术的发展,基因治 疗已成为治疗感染性疾病、遗传疾病、神经系统疾病以及肿瘤的新焦点。用于基因治疗的载体系 统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载 体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等,但是这些载体均存在不足之处,严重影响 了基因治疗的有效性及安全性。在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无 法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳 定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞,还具有容 纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点,在基因治疗中具有广泛的应用前景。现以HIV-1 为例,就慢病毒载体的生物学特征、慢病毒载体的构建、在基因治疗中的应用以及生物安全性等 方面作一综述。
一、 　慢病毒载体的生物学特征
          慢病毒包括灵长类慢病毒,如人 类免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ,以及非灵长类慢
病毒如猫免疫缺陷病毒( FIV) 、马传染性贫血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和维斯纳-梅迪病毒(VMV) 等。目 前,HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV 被广泛研究用作基因治疗的载体,而其中又以HIV-1最为热 门。
1.1 　HIV-1 病毒形态与结构
        成熟的HIV-1 病毒直径100～120 nm、呈20 面体对称结构、球形,电镜下可见一致密圆锥状核心,内有病毒RNA 分子和酶,后者包括 逆转录酶 、整合酶(integrase) 和蛋白酶(protease) 。HIV-1 的最外层为脂蛋白包膜,膜上有表面蛋白 (gp120) 和相嵌蛋白(gp41) 两种糖蛋白,gp120 为刺突,gp41 为跨膜蛋白。包膜内面为P17 构成 的基质蛋白(matrix) ,包膜内为衣壳蛋白(P24) 包裹的RNA。
1.2 　HIV-1 病毒 基因组结构及其功能特征
         HIV-1 的基因组由两条相同 的正股RNA 链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。病毒基因组全长约9200bp ,含有gag、 pol 、env 3 个结构基因以及tat 、rev、nef 、vif 、vpr 、vpu 6 个调节基因。在病毒基因 组的5′端和3′端各有相同的一段核苷酸序列,称为长末端重复序列(long terminal repeat ,LTR) 。gag基因编码p55 的蛋白前体,经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7) 、内膜蛋白 (p17) 和衣壳蛋白(p24) 。pol 基因编码病毒复制所需的酶类,env 编码gp120 和gp41 两种包膜 糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。tat 基因编码的gp14 是一种反式激活的转录因子,与LTR 结合后能促进病毒所有基因的转录。rev 基因编码的产物gp19 能促进未经拼接的大mRNA 分子从 细胞核向胞浆转运,并相对减少拼接后小mRNA 分子的数量。nef 基因编码负调节蛋白,对病毒的 结构蛋白和调节蛋白的表达均有下调作用。vif 编码产物与病毒体的感染性有关,vpu 产物与病 毒的装配、成熟和释放有关,而vpr 编码产物的功能尚不清楚。
1.3 　HIV-1 生 活史
         HIV-1 病毒通过 gp120 与宿主细胞的CD4 分子和趋化因子受体结合,然后将病毒的基因(RNA) 、蛋白及酶等释放 到宿主细胞内;随后,逆转录酶将病毒RNA 转录成DNA ,病毒DNA 在整合酶的作用下插入宿主细胞 核的基因组中,此时的病毒DNA 也称为原病毒;紧接着,原病毒转录成mRNA ,mRNA 从细胞核进入细 胞质,并利用宿主细胞的原料合成病毒的各种成分(蛋白质) ,新合成的各种蛋白、酶及RNA 等聚 集在宿主细胞的膜下,病毒的包膜蛋白(gp120 ,gp41) 插入宿主细胞的细胞膜并形成一种未成熟 的病毒(此时病毒无传染性) ;最后蛋白酶将病毒核心中的许多过长的蛋白及酶切短,便形成成熟 的病毒。病毒利用宿主细胞的细胞膜将自己包被起来,离开该细胞去寻找新的宿主。
1.4 　慢病毒载体转导非分裂期细胞的分子机制
         慢病毒载体能转导非分裂期细胞,3 种 分子元件决定了这种能力:MAN、IN 和vpr 。这3 类蛋白利用细胞核的输入机制,靶向作用于细胞 核的前整合复合物( PIC)。细胞核的输入系统包括: 胞质蛋白、importin-a 、importin-b 及核 孔蛋白。importin-a 含有一个细胞定位序列(NLS) 的结合位点,当含有NLS的蛋白与importin-a 结合在一起,发生构象变化,与importin-b 相互作用,然后importin-b 通过与核孔蛋白结合,靶向 作用于核孔复合物。而在实际构建时,vpr 可以完全敲除而不影响慢病毒载体感染非分裂期细胞 的能力。
二、 　慢病毒载体的构建
2.1 　早期HIV21 来源的慢病毒载体
         早期构建的HIV21 来源 的慢病毒载体,是作为研究HIV21 生物特性的工具,而非作为基因转移载体。该慢病毒载体包含了 完整的病毒基因组,仅仅是在env 基因框内插入了一个报告基因,由于存在病毒滴度较低,以及产 生有复制能力的反转录病毒(RCR) 的巨大风险,这种载体从未被考虑用于基因治疗。但是,这种载 体可以应用于病毒的生物学研究。
2.2 　第一代HIV-1 来源的慢病毒载体
         以Naldini 以及Kafri 构建 的三质粒系统为代表。该载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3 种质粒组成。载体质粒携 带了5′端LTR 和全部5′端非翻译区域(包括gag 编码序列的350 个核苷酸) ,另外还带有rev 应 答元件(Rev responsive ele-ment ,RRE) 及3′端LTR。其瞬时表达盒采用巨细胞病毒(CMV) 启 动子及增强子元件,在某些研究领域,可以携带绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基 因作为生物标记。包装质粒由HIV-1 前病毒基因组作简单修改得到,其5′端LTR 由异源病毒启动 子/ 增强子元件取代。为了防止来自辅助质粒的RNA 衣壳化, 特意将5′端主要剪接供体位点 (splice donor site) 和gag 编码序列起始端之间的包装信号区(E/Ψ region) 删除,而下游的 启动子由外源多聚腺苷酸信号(poly A) 取代。另外,利用点突变将env 编码序列打断,但仍然保 留rev 反应元件。这样的辅助结构能表达所有的病毒蛋白,包括tat 及rev(env 除外) 。env 由 单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。本系统包膜质粒的改进之处在于,引入 了VSV-G基因表达包膜结构,这样做的结果至少具有3 个方面的积极意义: ①包膜的更换进一步降 低了HIV-1 载体恢复成野生型病毒的可能; ②使HIV 载体感染宿主的范围不再仅限于CD4 + 细胞 ,而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞; ③VSV 的包膜赋予HIV 载体颗粒高度的稳定性,使其 能够通过超速离心而浓缩,达到高滴度。使HIV-1 载体滴度由105 转录单位( TU) / ml 达到 108TU/ ml 。这样的改进无疑是HIV 载体系统走向应用而迈出的一大步。
2.3 　 第二代HIV-1 来源的慢病毒载体
         尽管第一代载体产生RCR 的几率极小, 仍然不能忽略产生的可能性。毕竟包装质粒可以表达除env 外所有HIV-1 病毒蛋白,其中部分蛋 白与HIV-1的毒力密切相关,且已发现部分蛋白对细胞存在潜在的毒害作用,比如:vpr 可引起细胞 周期停滞,vif能抑制某些细胞的生长而Nef 能引起凋亡。1997年,Zufferey 等将包装质粒上的 vif 、vpr 、vpu 和nef 基因敲除,从而得到第二代慢病毒载体,而其他方面与上述第一代载体系 统一致。研究发现即使全部4 个调节基因都被敲除。病毒颗粒的产量也不会受到影响。这种载体 仍然具有体外感染非分裂期细胞、在体感染分化成熟大鼠神经元的能力,但是目前尚不能确定这 种载体是否能转染全部种类细胞。由于敲除的调节基因与野生型HIV-1 病毒的生活周期以及毒力 密切相关,所以这些载体即使发生多位点重组形成RCR ,亲代病毒仍不具有致病性。
2.4 　第三代HIV-1 来源的慢病毒载体
         利用慢病毒来源的包装系统的最大问 题在于生产过程中可能产生复制型病毒。当质粒DNA 转染进入包装细胞,以及辅助质粒及载体质 粒的RNA 包装入同一病毒颗粒时,将有可能发生重组。减少这种可能性的方法之一就是减少辅助 质粒与载体质粒的同源性。另一个方法便是将gag/ pol 和rev 编码序列隔离,分散在不同的质粒 。这样的包装系统需要四质粒来代替原有的三质粒包装系统。质粒一携带了gag/ pol 编码序列 及RRE;质粒二包含了编码rev 的序列;质粒三是载体质粒;质粒四表达env。采用四质粒代替三质 粒系统、除去tat 均减少了产生复制型病毒的可能性,从而增加了载体系统的安全性。
2.5 　自身失活型(SIN) 慢病毒载体
         由于具有逆转录方式的特点,在逆转录 过程中存在于病毒基因组3′端U3 区的启动子/ 增强子元件将被复制,并置于前病毒两端的LTR。 因此,3′LTR 的U3 区启动子发生失活突变后,将在逆转录过程中转移至5′LTR。如果这样的载体 整合入靶细胞,将不会产生完整长度的载体RNA ,因此命名为“自身失活型载体”。这种技术最先 应用于莫洛尼氏小鼠白血病病毒(MoMLV) 载体和鸟类的脾坏死病毒(SNV) 载体。进一步研究表明 ,U3 区的频繁突变将导致病毒滴度下降,原因是该区域的某些序列是载体有效多聚腺苷酸化所必 需的。在HIV-1 基因组内,核心多聚腺苷酸化信号存在R 区。现已证实,U3 区序列能影响多聚腺 苷的酸化效率。与MoMLV 相比,将HIV-1 的3′LTR U3 区(除上述多聚腺苷酸化增强相关序列,以 及病毒整合酶识别的U3 区5′末端外) 删除后并不会影响滴度。这种删除能确保病毒RNA 逆转录 并整合入靶细胞染色体后,从5′LTR 端启动子起始的复制被有效抑制。这种设计的另一个优势是 能增强瞬时表达效率,这可能与减少了病毒LTR 和细胞启动子之间的启动子竞争有关。
2.6 　其它类型
         在改进慢病毒载体生物安全性的同时, 科学家们在基因转移效率方面对病毒载体做了一些改构,以期提高目的基因的转导效率及在靶细 胞中的表达效率。Zufferey 等将美洲旱獭肝炎病毒的翻译后调节元件(WPRE) 插至载体3′末端 。翻译后水平WPRE可以促进转录物出核,还可以通过上调初级转录物的多聚腺苷化,来增加胞内信 使RNA 总量,最终改进转移基因的表达效率。另外,科学家尝试在SIN 载体中修复118bp 的cPPT序 列,发现在分化与非分化灵长类动物细胞中,载体转导效率显著提高。