慢病毒——基因转移的潜在新载体【上】
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三、 慢病毒载体的包装
大部分研发人员目前都使用瞬时转染293T 细胞的方式生产病毒载体。这种方法的缺点在于生产获得的病毒载体可能会出现有缺陷的基因组。为了生产高质量的载体,必须筛选合适的包装细胞系,而建立包装细胞系的最大难点在于某些病毒蛋白具有细胞毒性。比如, vpr 能诱导细胞停滞在G2期,不利于建立vpr 蛋白高表达的细胞系,病毒蛋白水解酶同样能水解细胞内的蛋白,不利于建立稳定表达病毒gag-pol 蛋白的细胞系;VSV-G蛋白的表达同样对细胞具有毒性。目前,为了建立合适的慢病毒载体包装细胞系,许多科学家都在尝试使用诱导型或可调节的启动子来克服病毒蛋白的细胞毒作用。
四、 慢病毒载体滴度的测定
慢病毒载体滴度可以参考腺病毒载体滴度的检测方法,将病毒与293 细胞共培养后,通过流式细胞仪检测GFP 蛋白表达水平来分析病毒滴度,病毒滴度为表达GFP 的细胞数乘以相应稀释倍数。另外,还可以通过TaqMan PCR 检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。
五、 复制型慢病毒(RCL) 的检测
应用慢病毒的基因载体的首要问题就是复制型慢病毒(RCL) 的产生。虽然现在还没有明确的指导方针,但是目前多个国家都制定了复制型逆转录病毒(RCR) 的检测方法。在实验室研究领域,科学家提出通过将病毒载体与293 细胞等指示细胞共培养,293 细胞传数代后检测细胞中是否含有gag 序列的方法来确定是否存在RCL 。如果收集的病毒载体不含有RCL ,则与293 细胞共培养后不发生增殖,gag序列检测即为阴性。另外,还可以应用更为敏感的RT-PCR 检测gag 及VSV-G RNA 判断293 细胞上清中是否含有RCL 。
六、 慢病毒载体在基因治疗中的应用前景
6.1 获得性免疫缺陷综合征的基因治疗
目前对于AIDS 的基因治疗方案,基本上是由反转录病毒载体将抗病毒基因体外导入CD4 + T 淋巴细胞或CD4 + 的造血祖细胞,再回输体内。常用的抗病毒基因包括自杀基因、反义RNA、核酶、RNA 诱饵的相应DNA 序列,以及调节蛋白或结构蛋白的突变体基因等。由于这些治疗基因不能到达巨噬细胞和多能干细胞,因此难以重建免疫;此外,体外操作费用昂贵,不适于大规模应用。
HIV-1 载体的研究为AIDS 的基因治疗带来了新的希望,它可能具有以下优势:第一,HIV-1 自身的包膜蛋白env 包裹的载体颗粒可以将抗病毒基因直接运抵CD4 + T 淋巴细胞和巨噬细胞,适于直接的体内治疗,而包被了VSV 包膜的载体颗粒又能感染多能干细胞,有利于免疫重建;第二,患者体内的野生型HIV-1 可将携带抗病毒基因的HIV-1 载体拯救出来,使载体扩增并扩散到周围更多的细胞中发挥抗病毒作用;第三,如果将抗病毒基因置于HIV-1 本身的长末端重复序列(LTR) 控制之下的转导细胞,则只有当HIV-1 感染该细胞时, tat 蛋白反式激活LTR 中的TAR 元件,抗病毒基因才会表达,使基因表达具有了靶向性。
6.2 神经系统疾病的基因治疗
帕金森氏病是一种由于大脑纹状体内多巴胺水平降低而引起的退行性脑病,临床上以注射左旋多巴改善症状,但长期注射的不便及药物的副作用令患者难以承受。较为理想的治疗方式是在脑内持续表达酪氨酸羟化酶(TH) ,使其催化酪氨酸转变为为左旋多巴;Alzheimer 氏病也是一种多因素引起的退行性脑病,造成大脑皮质和海马回神经元萎缩,通常采用神经营养因子防止神经元退化。由于HIV-1 载体能够体内转导神经元并建立长期稳定的表达,因此上述疾病的慢病毒载体基因治疗将极具潜力。应用慢病毒载体进行胶质源性神经营养因子(GDNF) 、酪氨酸羟化酶(TH) 体内基因治疗,可改善PD 大鼠的旋转次数,保护多巴胺能神经元、防止神经元退化,起到治疗帕金森氏病及Alzheimer 氏病的效果。
6.3 血液系统疾病的基因治疗
Pawliuk 等构建的βA珠蛋白基因变体βA-T87Q能阻止HbS 的多聚化,以HIV-1 载体将该基因转染人造血干细胞,并能在人红细胞系可以表达。在镰状细胞贫血(SCD) 小鼠模型移植人造血干细胞后,转基因获得长期表达,在循环血中99 %的红细胞及52 %的血红蛋白有红系特异性转基因表达,镰状细胞贫血得到改善,血液学指标、脾脏肿大及特征尿浓缩功能缺陷得到纠正。May 等构建含人β珠蛋白启动子和增强子调控的人β珠蛋白基因的HIV-1 载体,在载体转染的MEL 细胞中,正常β珠蛋白可达到正常内源性β珠蛋白产量的70 %以上,使Β-地中海贫血得以较好的纠正。Yamada 等将Fanconi 贫血(FA) C 型患者的EB 病毒刺激转化的原始淋巴细胞作为靶细胞,用HIV-1 载体将FAC 型cDNA 转入靶细胞,用丝裂霉素C 药物抗性监测FA 细胞表型的纠正情况,效果显著。慢病毒载体以其独特的优势,在血友病的基因治疗中有较好的应用前景。Park 等构建EF-1α增强子/ 启动子调控hF Ⅷ或hF Ⅸ表达的HIV-1 载体,经门静脉注入C57BL/ 6 小鼠,其血清hF Ⅸ水平随着载体数量的增加而增高,最高可达50～60 ng·ml - 1 ,这表明慢病毒载体在体内可以产生治疗水平的凝血因子。目前,少数国外研究机构已经开展以慢病毒载体为基础的基因治疗临床试验研究。
6.4 肝脏疾病的基因治疗
肝脏的基因治疗策略通常是“增加基因”,通过导入正常的基因,代替缺陷或缺失的内源基因起到治疗作用。如苯丙酮尿症、酪氨酸血症、Wilson′s 病和LDL 受体缺陷症等。Nguyen 等证实了来源于第三代HIV-1 载体能够有效的控制传递、整合、稳定表达转基因进入人原代肝细胞。可以预计,利用慢病毒载体来介导治疗基因进入肝细胞内,将起到一定疗效。
6.5 其 他
最近,Goldman 等用HIV-1 载体进行了尝试,动物实验表明,导入CFTR 基因后囊性纤维化(CF)缺陷可被纠正。但同时也发现,HIV-1 载体转导分化中的呼吸道上皮细胞效果较好,而对完全分化的上皮细胞的转导效率则非常低。目前尚不完全清楚转导受限的机制。色素性视网膜炎是一种遗传性的进行性视网膜退变,症状包括视野进行性减小、夜盲、视网膜色素沉着等。研究发现, 将视杆细胞cGMP 磷酸二酯酶-γ亚单位基因导入感光细胞,有可能纠正视网膜退变。由于成熟的视网膜细胞绝大部分为终末分化细胞,在选用载体系统上受到很大限制,慢病毒载体以其转导非分裂期细胞的能力,给该疾病的治疗带来了希望。
七、 生物安全性
慢病毒载体安全性方面最令人关注的是重组产生具有复制能力的逆转录病毒(RCR) 。病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共转染包装细胞系如人类胚胎肾细胞而产生,病毒载体颗粒的核心和酶的成分来源于HIV-1 ,衣壳来源于另一病毒,最常见的是VSV ,其产物G蛋白具有高度的稳定性和广泛的亲嗜性。最新一代的慢病毒载体(第3 代)只含有HIV-1 共9 个基因中的3 个,即gag、pol 、rev。由于HIV-1 基因组成分中60 %被去除,因此父代病毒无法复制,载体本身只是将目标基因转移到靶细胞内的工具。利用逆转录机制构建自我失活(SIV)的HIV-1 来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题。以HIV-1 为基础的第3 代慢病毒载体系统的安全性甚至超过了目前临床试验正在使用的致癌性逆转录病毒载体。
八、 结 语
迄今种种努力表明,在保证HIV-1 载体安全性的基础上,要产生有复制力的HIV ,必须在不同的质粒上发生多次非同源重组事件。总之,慢病毒载体在基因转导方面的良好特性,必将成为基因治疗的有力工具,值得进一步深入研究。
